桑葉中多糖的提取與分析方法的研究

由于科技技術的不斷進步以及人們生活水平的不斷改善,保健營養品越來越受到人們的關注,尤其體現在原材料是否采用天然材料方面 ,而天生就具有美譽的“神仙草”——桑葉,便逐漸走入了人們的視野中,隨著其市場的興起,不少科學家、研究人員對桑葉進行了多方

  1、緒論

  1.1研究背景與意義

  1.1研究的背景和意義
  由于現在人們的生活水平不斷得到改善,人們越來越注重自己的身體健康問題。這就使得當下一些古老的醫療保健用品漸漸不能達到人們的要求,另外,一些醫療保健品的加工過程繁瑣工藝復雜,往往被認為在生產過程中雜質過多,人們通常不會考慮購買。在一定程度上,人們越來越偏愛采用天然材料的生產的醫療保健品,此時,自然界的動物以及植物作為醫療保健品的原材料越發得到人們的關注,越來越多的科研人員開始重視并且開展了許多研究分析工作。通過翻閱相關的科學技術文獻以及相關的研究報告,可以發現:在動物以及植物中蘊含了相當多的生物活性物質,比如:一些生物堿、多糖類物質、酶類等物質,這些物質起到維持個體的正常的生命活動,使得個體飽含生命活力,因此上述的物質被人們視為人體必需的健康因子,在保持人體健康方面起到相當大的作用。在上述的生物活性物質中,人體最為需要以及最重要的就是多糖類物質。對于多糖而言,其本質上是一種由生物產生的高分子化合物,其能夠起到相當多的生物活性作用并且還能夠起到一起保健作用。因此,對于當前市面上在售的大部分藥物以及保健品而言,多糖基本上是它們的主要組成物質,可見其功能作用較多并且地位相當高。除了起到預防和治療某些疾病的作用,還可以在治療癌癥方面發揮一定的效果。對此,不少科研機構加大對多糖的研究并做了相應的實驗,多糖以其市場潛力以及價值越發吸引人們的注意力,研究以及留意該物質的人士日益增多。另外,生物利用糖類生成組織等身體機構,同時也為日常的生命活動供能,是主要的供能原料。糖類物質的生物學功能說明在生物的正常生命過程中糖類起到相當重要的作用,可以說是生物不可或缺的生命基礎。在自然界,多糖的載體相當豐富,怎樣選擇檢測標本進而有利于檢測是一個值得研究以及商榷的事情。筆者在翻閱相關文獻資料的基礎上,了解到桑葉中多糖物質的有待深入的研究分析。中國種植桑樹的歷史相當悠久,桑樹的種植持續了上千年,到今天也得到了廣泛的種植??梢哉f桑葉的獲取相當容易,來源十分豐富,種類也是相當多。研究產量豐富、材料易得的桑葉是一個比較好的課題,經過對其細胞中的多糖類物質的研究,并經過提取提純處理后展開相關的實驗,接下來一步一步確定該物質最有效的提取條件,這種提取工藝具有相當高的價值。所以,對桑葉細胞中的多糖物質進行相關的研究并進行提取處理具有相當大的價值。多糖擁有的具體生物活性有以下五點明顯作用:
  1、提高免疫力;世界各國都有相關的權威研究證實,多糖能在一定程度上提高機體的免疫能力,因為多糖的結構會很大程度決定多糖的功能,所以,架構不一樣的多糖存在很多不一樣的免疫作用。在香菇多糖輔助淋巴T細胞之下,如若機體收到刺激,將更快的參與生理反應。尤其是癌細胞產生或者入侵時,其還有能力幫助機體更快的修復免疫功能。
  2、降低血糖、血脂:當代人類的三大疾病之一——糖尿病,其本質是因為內分泌物造成的。借助細致的分析后能知道,多糖是借助增強小鼠體內胰島的分泌能水平,是的胰島素產生的數量增加,從而提高或者減小有關酶的活性從而達到降低血糖的功能;遺憾的是,當前使用多糖進行降血糖還只是在臨床試驗階段,且部分工藝還有待提高,還未能達到能正式使用的階段。
  3、抵抗腫瘤活性:有許多多糖物質都具有一定的抗腫瘤活性,當前,人們已經可以通過細菌、真菌等提取得到這類多糖,而且還有不少數具有高抗腫瘤活性的多糖已經進入了臨床試用階段,我們有理由相信,多糖在抗腫瘤活性方面的研究將迎來新的春天。
  4、抗輻射:部分多糖能或多或少的提升抗輻射水平。曾經有人做過實驗,設置兩組小白鼠,A組不作要求,B組輸入茶葉多糖,將兩組放在相同實驗條件下進行輻射劑量大小一致的照射,結果表明B組的小白鼠成活率比A組高33%。
  5、其他作用:由于對多糖的了解還有待深入,所以當前人們也沒有對其知根知底的了解,在其他作用方面,有比較顯著的效果有:海帶多糖能起到減肥作用;九里香多糖能對生物體的損傷進行修復;等等。
  總的來說,多糖目前的研究已經給人們帶來了諸多便利,這也是為什么越來越多的人加入到多糖的研究中,同時多糖也是人體維持正常生命活動的必要物質,而且其對于一些頑疾也有著特殊醫療效果,無論從藥品角度,還是從保健品角度,多糖的使用還有很大的發展空間。

  1.2多糖的研究進展

  1.2多糖的研究進展
  多糖(polysaccharides),即多聚糖。從其微觀組織上來看,是由十個以上單糖連接而成,其中起到連接作用的主要是苷鍵。不過通常情況下,多糖所包含的單糖基均在百個乃至千個以上、多糖雖然由單糖組成,但是與單糖相比,多糖的性質有著極大的改變,而這種改變中最明顯的兩點便是單糖本身所含有的甜味以及強還原性比較小。多糖有多種不同的分類方法,結合本文的研究,筆者從多糖在生物體內的功能出發,對多糖進行分類,主要分為不可溶于水以及儲存養料兩種。其中不溶于水的主要是動物的支持組織,從結構上來看,這種支持組織以直鏈型居多,而主要用于儲存養料的多糖多是可溶于水的,尤其是在熱水之中,其能夠迅速的溶于其中,并且發生反應之后呈現出膠體溶液之態,在其呈該種狀態之下,通過酶催化,能夠產生出淀粉等,這種多糖分析接夠可以促進植物的生長。
  均多糖(homosaccharide),是多糖的一種,也可以將其看成由單一一種單糖所組成的,如果是由多種類型的單糖所組成的,那么這種類型的多糖便被稱為是雜聚唐。多糖存在的范圍極廣,并且存在的地方不一,在動物體內,多糖多存在于體細胞膜之內,而在植物體內則多糖存在于細胞壁之中。另外,因為構成多糖的結構不一,所以種類極多,單從自然界不同動植物中提取的多糖就有數百種,如鯊魚軟骨多糖、仙人掌多糖等。
  多糖出現在所有動植物和微生物細胞壁中。一個多世紀前,德國化學家E.Fischer研究出糖類以及其復合分子在生物功能上是獨特性,為后來人們探索糖類應用奠定了重要基礎。在20世紀50年代,通過相關相關學者的探討,人們發現了真菌多糖擁有令人驚喜的抗癌活性,能夠起到一定程度的抗癌效果,從此人們對多糖化學特性領域的研究更加關注。緊接著,諸多表明糖類物質的重要構成——多糖類物質具有與眾不同的生物活性功能的研究紛紛見諸于世。截止目前,在多糖化學特性研究領域已經取得了很多成果。Glombitza KW等學者在探究中得出結論:分離酸棗仁丁醇提取物所得到的Christinin A能夠借助其所含有的皂甙糖,使糖尿病鼠模型的糖水平與肝磷酸化酶活性降低、令清胰島素含量和肝糖原量有所提高。Tomoda M等學者的研究證明植物粘液具有降血糖的功能。Isiguld K.以18名糖尿病患者作為實驗對象,安排其在飯后飲用含茶多糖的飲料,經過4周的試驗期,對其糖基化血紅蛋白值和血糖含量進行二次檢測,得出糖基化血紅蛋白值和血糖含量檢測有顯著降低。Konnoc等學者則在大量研究基礎上從人參中分離出人參多糖,多達21中,并在對其進行作用測試后發現,人參多糖能夠在很大程度上減少患有四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖含量。
  隨著新世紀的到來,科技和生產力的發展促使了細胞學和生物學的發展,加上儀器的精密度提高和分析技術的更為地科學,我們對于糖類的研究也更為深入,也逐步建立了關于糖類的研究學科,對于多糖功能的了解也更為全面具體。故而可以說,我們已進入了“多糖生命科學”的時代。

  1.3多糖的化學組成及結構

  我們常說的糖類實際上主要是碳水化合物組成的,碳水化合物是碳原子上附帶了很多的多羥基醛或者多羥基酮,其也可以稱為利用水解生成多羥基酮(或醛)的類化合物。以糖類的組成結構和性質能夠將其分類,主要有以下幾類:第一類是單糖,第二類是二糖,第三類是寡聚糖,最后一類是多糖。對糖分子加以分析,我們不難發現,一個糖分子當中還含有若干個原子,這些原子的特點是非對稱,這也是導致大多數的糖分子具有旋光性特點的原因。如圖1-1和1-2所示,其為單糖D一葡萄糖以及D—葡萄糖醛酸的結構示意圖。圖1-3則是多糖纖維素的結構示意圖??梢?,多糖纖維素的鏈接是有眾多直鏈葡萄糖作為媒介進而形成的。因此,關于多糖我們可以得出這樣的結論:由多個單糖彼此之間依靠苷鍵連接起來相互組成了多糖。而這些單糖連接的方式是不一樣的,不同的連接方式會導致形成的多糖也不一樣,多糖根據單糖的連接方式可以分為三類,主要的類型有:直鏈多糖、叉鏈多糖以及環狀多糖。
桑葉中多糖的提取與分析方法的研究
  圖1-1 D-葡萄糖圖1-2 D-葡萄糖醛酸圖1-3纖維素
  多糖的不同類型還取決于構成其單糖的種類、單糖的比例,而一個糖分子上面所含有的原子的基團與數量位置等也會影響最后形成的多糖的種類。當然也會因為其所含苷鍵類型、比例以及其支鏈大小而異,多糖在結構上比蛋白質的結構更為復雜多樣,究其原因主要是能夠組成多糖的那些單糖具有很多的種類,哪拍是只有一種單糖,不同的連接方式也可能會致使其產生分支,當然,蛋白質是沒有分支的。正因為以上原有,多糖有很多種結構,對這些結構進行歸類劃分的話,可以劃分出四種,分別是:
  首先是第一種類型,一級結構:對于糖基而言,它一般是構建在一級結構上面的,當處于一級結構的時候,糖基的排列順序是由特定序列的,判斷是否為一級結構的時候要觀察相鄰的糖基之間連接的方式特點,如果連接方式有分枝的話,分枝在什么位置以及該分支的長短特點是什么。如果拿蛋白質與其比較的話,蛋白質的結構相對來說都算是簡單的??梢娞堑囊患壗Y構是多么的復雜。
  接著是第二種類型,二級結構:多糖的二級結構實際上是一種聚合體,主要是由多糖的骨架彼此連接而成,這種連接是通過氫鍵的方式連接起來的。與一級結構的連接方式不同,二級結構的主要是多糖分子中主鏈的構象,與側練無關,因為側鏈沒有參與到二級結構的空間排布中。而在結構排列中。一級結構是二級結構的基礎。
  其次是第三種,三級結構:三級結構也可以理解為非共同價作用的產物,這種共同價是因為一級結構中唐單位的羧基、氨基或硫酸基相互作用產生的。因此導致了原本有序的二級結構出現了有規則而粗大的改變所形成的構象。
  最后是第四種,四級結構:四級結構也是為供價作用形成的,而這種是多種聚集體的集合,是由于多個多聚鏈通過非共價產生的。這種多糖鏈并不是只存在于相同的分子之間,不同的分子之間也可可能會形成聚集作用。單糖殘基如果是按照單一的個體來觀察的話,可以發現在空間上面主要呈現多糖的結構形態特點。進一步研究觀察這些空間等位置特點,對于研究多糖生物是有著重要的意義的。

  1.4研究內容

  1.4.1多糖的提取方法研究
  多糖的提取方法眾多,也各有特點,最具代表性和實操性的有以下五種:
  1)熱水浸提法:
  上個世紀多用此類方法提取多糖,是一種傳統方法。其原理是:可提取物質易溶于水,通過過濾或離心將其與不溶物分離。
  優點:設備易獲得,易操作,環??煽?。
  缺點:熱水浸取法的過程需要數噸水,而且也要大量的使用乙醇進行醇沉淀,最后由于時間和溫度也會對多糖產物的結構有或多或少的影響。
  2)超聲波提取法:
  對于超聲波而言,它在對多糖進行提取的時候,一般是按照是空化效應來得到的。如果液體里有特別小的核心,那么就會因為超聲波的刺激而不斷地被激活,從而導致收縮等現象,由此造成液體里出現高壓等情況。按照“先扭曲,再中斷,最后釋放”包裹物的順序來減少提取時間。
  優點:操作實驗過程段,效率很高。
  缺點:此法只能在實驗室中實現,大量的工業生產不可行。
  3)微波提取法:
  顧名思義,此法需要微波輻射來完成,微波能夠對溶劑產生作用,它能夠通過細胞壁從而滲透到細胞內部。細胞液以及溶劑會能量進行有效的吸收,而且如果當壓力大于了細胞壁容積能力的時候,細胞壁就會撐破,會形成諸多小孔,而活性物質就會通過小孔釋放出來。
  4)酶解提取法:
  此法是通過酶具有專一性、高效性來實現的。酶解提取法可以無視細胞壁對多糖的阻擋,從而能夠得到快速的釋放,如此可以將成分提取出來。在所有的反應過程里,它都存在特別溫和的條件,能夠最大程度地對生物活性進行保障,具備特別大的潛力。按照提取階段里酶的使用情況能夠知道,一般都包含了下列兩類不同的方法:單酶提取法以及復合酶提取法。
  隨著生物工程和技術的快速發展,有關酶工程技術的研究也成為生物研究領域的一個新出發點。
  優點:多糖產率是這幾類方法中最高的,實驗條件容易達成。
  缺點:制作成本過高,性價比較低,且酶的引入可能會帶紙多糖的純度受到影響。
  5)超高壓提取法:
  這種方法是在常溫下作為有效對植物成分進行提取的一個有別于以前的技術。它色工作原理對物質展開持續的壓力降低,并且這是通過加壓裝置實現的,與此同時,還會進行降壓操作,如此能夠讓細胞里的壓力產生較大的變化,如此能夠讓細胞壁因為壓力的影響而出現破裂的情況,其中的內含物就能夠最大程度地進行釋放。
  該方法的優點是提取時間短、雜質少、能耗低、提取率高,是一種有較大潛力的提取方法。但和超聲波提取一樣,這種方法目前只適用于實驗室,工業化生產桑葉多糖還不能實現。
  總結:根據筆者能開展的實驗條件以及工藝方法和流程,通過上述對比,最后決定使用水提法進行實驗,同時以超聲法輔助提取。
  1.4.2多糖的分離與純化研究
  經過水提取的方法后獲得桑葉多糖粗提液,其液體呈現不透明的掩飾,這是因為溶液中含有許多雜質造成的,其中的雜質包括蛋白質、葉綠素、葉黃素、生物堿之類的物質,因此如果想得到純度較高的多糖溶液,那么必須最大程度上過濾到上述的雜質。實驗方法如下:
  1)除蛋白
  對于桑葉多糖粗提液而言,在其所有的雜質以蛋白質為主。通過相關的生物技術,例如鹽析法、蛋白酶法等技術可以有效去除溶液中大部分蛋白質。然而,僅適用等電點沉淀法以及加熱變性法無法百分百除掉溶液中的蛋白質。此外,對于等電點沉淀法而言,其對操作人員的要求較高,并且該方法的成本極高,但是桑葉中多糖的回收率卻不高。經過對比研究國內外的祥光資料,發現當前時期Sevag法和三氯乙酸法優勢明顯。其中,Sevag法的原理為通過三氯甲烷-正丁醇混合溶液可以凝固蛋白質的作用將粗提液中溶解的蛋白質凝固后沉淀,再用萃取法除去桑葉多糖中的蛋白質。通過實踐發現,這種方法優勢明顯,然而效率不高。對于三氯乙酸法而言,其原理為在酸性溶液中由于蛋白質與三氯乙酸的酸根可以結合產生沉淀,進而可以去除粗提液中的蛋白質雜質。
  2)脫色
  另外,桑葉多糖粗提液中有許多葉綠素、葉黃素等色素雜質,能夠采取多糖與色素理化特性的區別進行去雜質處理。對于這種雜質的去除方法常用的有以及幾種:大孔樹脂吸附法、澄清劑法、活性炭法。第一種方法才做簡便,不僅能保護環境,而且性價比高,能滿足大規模生產的需要。脫色后再用乙醇進行沉淀,從而得到多糖的純化物。
  1.4.3多糖的分析與檢測研究
  通常使用苯酚—硫酸法量化商業中多糖的含量,其原理為糖類在濃硫酸中可以產生水解,進而出現脫水反應產生糠醛及其衍生物,可以通過苯酚進行染色進行檢測。在苯酚-硫酸法中多糖在硫酸的中可以發生水解就形成單糖,然后在脫水的作用下產生糖醛衍生物,接著用苯酚進行著色,用比色法測定多糖的含量。使用紫外分光光度計,波長為490納米,待測物會在該波長處顯示出最大吸收峰。接著再配置葡萄糖標準溶液,空白對照組為經過相同處理之后的蒸餾水,經過測試后得到在490nm處葡萄糖溶液的吸光度值,然后繪制標準曲線圖。圖中橫坐標為葡萄糖的濃度值,縱坐標為吸光度。

  2、實驗部分

  2.1主要儀器與試劑

        如上圖↑

  2.2溶液的制備

  2.2.1葡萄糖標準試液的配制
  在燒杯里面放入葡萄糖,它的總量是10.00毫克,并且是通過天平獲取的,然后在燒杯里面倒入一定量的蒸餾水進行攪拌(玻璃棒攪拌)溶解。再利用玻璃棒將配置好的溶液轉移到100毫升的容量瓶里面去,為了防止溶液的浪費記得用蒸餾水將燒杯進行多次清洗,最后向容量瓶里面繼續添加蒸餾水直至達到標記刻度,將容量瓶蓋好以后上下左右搖擺均勻,0.1g/mL的葡萄糖標準試液就配制好了。
  2.2.2苯酚的配制
  準確稱量2.5克苯酚晶體,放入燒杯中,記住要一邊加蒸餾水一邊用玻璃板攪拌,等到蒸餾水加入完成以后,如2.2.1中玻璃棒引流的作用,再次利用這個原理將燒杯中的溶液轉移到容量瓶中(50ML的棕色容量瓶),然后同樣用蒸餾水做清洗并定容到規定的刻度處,將容量瓶蓋好以后上下左右搖擺均勻,5%的苯酚溶液就配制好了。
  2.2.3三氯乙酸溶液的制備
  選取實驗室中的天平(電子)稱取三氯乙酸5克,并將其放到燒杯里面隨后倒入一定量的蒸餾水攪拌溶解,接著同樣利用玻璃棒的引流作用將燒杯中的溶液轉移到容量瓶中去(50ML的棕色容量瓶),但是與2.2.2中不同的是,這里要立刻將燒杯中的溶液進行轉移,不能進行停留,然后同樣用蒸餾水做清洗并定容到規定的刻度處,將容量瓶蓋好以后上下左右搖擺均勻,10%的三氯乙酸溶液就配制好了。

  2.3標準曲線的描繪

  1、分別用滴定管汲取1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL已經制備好的葡萄糖溶液放到不同的容量瓶(10mL)中去,同樣的繼續取蒸餾水加到容量瓶中定容到規定的刻度線;
  2、取6個錐形瓶,分別加入2mL的溶液,然后再加入1mL的苯酚試液;
  3、振蕩錐形瓶使溶液混合均勻,快速將量取好的5ml濃硫酸溶液滴入錐形瓶,持續振蕩錐形瓶2分鐘,然后利用恒溫水浴加熱鍋對錐形瓶進行沸水浴加熱,加熱持續15min后停止;
  4、停止加熱后將錐形瓶取下并靜置冷卻直到室溫,采用紫外分光光度計測量錐形瓶中溶液在490nm時的吸光度;
  5、依次對不同濃度相應的吸光值進行記錄,并且根據記錄結果繪制曲線圖。

  2.4桑葉中多糖的提取工藝步驟

  2.4.1水提法工藝步驟:
  1、在機器中加入適量的桑葉研磨,完成后收集起來置于通風干燥處等待取用;
  2、稱取5g步驟1中研磨好的粉末置于容器里面,隨后加入適量的蒸餾水,加熱到相應的溫度提取多糖;
  3、靜置一定的時間以后,收取步驟2中獲得的提取液置于錐形瓶中;
  4、采用離心機對經過乙醇溶液沉淀析出的提取液進行離心過濾,最終得到粗多糖物質;
  5、將上述的粗多糖產品進行烘干處理,一段時間后測量其重量。
  2.4.2水提法實驗環境的設定
  通過相關文獻了解到,利用水提法對桑葉中的多糖進行提取時,具體提取過程中的溫度、時間、次數以及液固比都是影響提取結果的重要因素,所以針對這四個因素進行了單變量對照試驗的設計;
  水提法最佳提取環境的確定步驟:分別在50、60、70、80攝氏度的溫度條件下進行提??;時間每個一個小時,分別是1小時、2小時、3小時、4小時;提取液的固比分別為10:1,20:1,30:1,40:1。
  2.4.3超聲提取法實驗步驟
  1、在機器中放入數量干燥的桑葉,完成碾碎研磨后將桑葉拿出置于干燥通風的環境中;
  2、將稱量好的5克桑葉粉末放入超聲波細胞粉碎機,關閉裝置門,對需要的超聲功率及時間進行設置;
  3、經過一定的時間就可以將不同條件下產生的多糖提取液收集到錐形瓶中;
  4、將適量的乙醇加入到在錐形瓶中使溶液沉淀,再由離心機對沉淀進行離心過濾操作后得到多糖的粗產品;
  5、對多糖粗產品進行烘干操作后,將其靜置一會兒,用電子天平進行稱重。
  2.4.4超聲法實驗條件設計
  根據相關記載了解到,利用超聲法對桑葉中的多糖進行提取時,具體提取過程中超聲提取的功率、時間、液固比都是影響提取結果的重要因素,所以針對這三個因素進行了單變量對照試驗的設計;這里設定三個超聲功率分別為200、300、400瓦,然后是設定提取的時間,這里分別把三個時間設定為15、20、25分鐘,還有液體固體物質的比例,這里分別取其為10、20、30。以此三種參數分別做對照試驗,我們就能逐步逼近這種方法的最佳實驗條件。

  2.5對純度低的多產產品進行純化

  2.5.1首先去除蛋白質
  使用合適的蒸餾水來溶解上面獲得的多糖產物,隨后把的三氯乙酸溶液添加到其中,借用試紙來測定知道在上下,之后把該溶液放在的冰箱里冷卻,隨后把該溶解做離心過濾,對濾液進行減壓使得其達到濃縮的效果,隨之我們要使其沉淀,這里加入乙醇即可,乙醇的濃度在95%左右;之后需要在低溫下對溶液進行靜置處理,這里放到冰箱里36小時即可,最后把該溶液取出來,把獲得的沉淀物質在低溫條件下晾干,就能夠得到高質量的桑葉多糖。
  2.5.2然后對活性炭進行脫色處理
  前面制備了多糖成品,下一步要將之溶解在蒸餾水里,溶解完畢之后,便要加入活性炭粉做回流脫色,得到活性炭含量,過濾需要熱環境,冷卻待以后使用。
  2.5.3使用乙醇進行沉淀純化
  使用合適的蒸餾水來溶解脫色后的多糖成品,在把乙醇溶液加入其中,
  這里選取的乙醇濃度分別為50、60、70、80%,在這幾種不同的乙醇濃度下進行過濾,就可以得到不同的沉淀物了,然后進行烘干后就能夠獲得質量很高的多糖,待其冷卻以后稱量。

  2.6多糖粗產品含量的檢測

  稱量完畢之后,取其中最重的多糖成品,取1mg即可足夠使用,然后像前面的操作一樣,加入蒸餾水配成標準溶液,標準溶液的濃度為0.1mg/mL,然后取出標準溶液2ml,滴入錐形瓶中,加入苯酚,1ml,濃度為5%;然后手搖進行震蕩,等待其震蕩均勻之后,加入濃硫酸,這里要迅速的加入約5mL;然后再次進行反復的振蕩,等待振蕩兩分鐘之后,將其置入恒溫水浴箱中進行進行持續加熱,等待其加熱大約15分鐘后,取出進行降溫處理,等待其降低至室溫,然后就可以測定樣品的吸光度了,再之后使用吸光度來計算其含糖量。

  3、實驗結果與討論

  3.1標準曲線

  桑葉中含有的多糖屬于混合物,不可以直接加以測量,因此就必須找到其它的能夠替代三爺里多糖含量的物質當作合格品,采用紫外可見分光光度計檢測合格品葡萄糖溶液在之內的數據,可以把吸光度的光譜圖表示如下:
  葡萄糖的標準溶液吸光度曲線
  葡萄糖標準溶液在紫外可見分光光度計掃描圖
  上圖葡萄糖合格品在紫外可見分光光度計的照射下,形成的掃描圖清晰的表明了其最大吸光度的峰值波長,即在葡萄糖合格品中添加苯酚-硫酸試劑的情況下,通過紫外光照射,在490nm波長位置獲得最大吸光度,因此該波長位置可以選作樣品的特征吸收峰。
  通過對不同濃度的樣品溶液在選定波長處的吸光度檢測值進行平均值計算,將檢測到的吸光度值定義成縱坐標,葡萄糖溶液濃度定義成橫坐標,得到的標準曲線如下所示:
  葡萄糖溶液的標準曲線
  得到回歸方程是:,R2,說明在的區域內葡萄糖的溶液濃度與吸光度之間有明顯地線性關系。

  3.2水提法的最佳提取條件的確定

  3.2.1最佳提取溫度的確定
  葡萄糖粗產物質量與提取溫度的關系圖
  由上圖可知,當另外的三個因子不變時,提取時溶液溫度越高,獲得的多糖產物的量就越大,造成這種結果的原因是:多糖溶解度隨溫度的上升而提高,也在一定程度上使得多糖的傳質速度變快,另外桑葉的細胞壁經受不了高溫,容易被破壞,從而使得多糖更容易析出,在溫度為80℃的時侯,最多可獲得0.105g多糖,的提取率;同時溫度越高提取工藝越高端的現象也是不存在的,細胞壁內別的物質也被同時分離出來,也會影響多糖的含量。整體考慮,在明確最佳提取溫度的時候,將其設定成80℃
  3.2.2最佳提取時間的確定
  葡萄糖粗產物質量與提取時間的關系圖
  從該圖能夠了解到,如果選取最合適的溫度是時,當把液固比和提取次數當作定量來考慮時,則得到的多糖產物在開始時是增加的隨著時間的推移會慢慢的減小,是它的最合理提取時間,得到粗糖產物,的提取率;得出的結論是因為提取的時間太長了,細胞壁內別的物質也被同時分離出來,再加上多糖的成分也可能改變了,進而影響了它的提取率。掌握時間不但能降低提取的時間,還能夠獲得更高的粗糖提取率,所以這里最合理的時間定在。
  2.2.3最佳提取次數的確定
  葡萄糖粗產物質量與提取次數的關系圖
  從該圖能夠了解到,如果選取最合適的提取溫度80℃和最佳提取時間2h時,固定液固比,通過給實驗得到的多糖在開始時增加的很快,隨著時間的推移就會慢慢的走向平穩;次提取獲得的粗糖產物是,的提取率;次提取獲得的粗糖產物是,的提取率,和整體的提取率來比較,這增加了;在一定的環境下對此可能的因素做剖析,細胞壁內分離出來的多糖隨著時間的增加慢慢的趨于飽和,必要要增加其他條件或者是改變外界的環境也許會都它的分離物有影響;受工藝的限制影響,次提取以后就可以縮短時間,同時還可以得到更多的粗糖提取物,所以經過實驗吧定位最合理的提取次數。
  2.2.4最佳提取液固比的確定
  葡萄糖粗產物質量與提取液固比的關系圖
  從上圖中能夠了解到,如果另外三個使用最合理的提取條件時,則其取得的粗糖產量和液固比成正向關系,的液固比,能夠得到粗糖產物,就可以算出提取率是;的液固比,能夠得到粗糖產物,算出提取率是,通過比較能夠知道,這兩個的提取率都是比較高的;同時它們的液固比也是比較大的,另外還要主要實驗操作的實施性和材料的浪費原則,經過整體考慮得出,其最合理的液固比應該是。

  3.3超聲法最佳提取條件的確定

  3.3.1最佳超聲功率的確定
  葡萄糖粗產物質量與超聲功率的關系圖
  由上圖可知,在其他兩個工藝條件一定時,功率逐漸增加時使用超聲法提取的粗糖產物的質量先增加后減少,當功率為300w時得到的粗糖產物質量最多,達到0.382g,多糖提取率為7.64%;產生上述現象的原因可能是超聲的功率過大時會導致桑葉細胞壁內側部分成分損壞甚至導致多糖的流失變性,所以應該選擇一個最佳的超聲功率來提取葡萄糖粗產物,根據實驗可知當功率為300w時得到的粗糖產物最多。
  3.3.2最佳超聲時間的確定
  葡萄糖粗產物質量與超聲時間的關系圖
  由上圖可知,在使用了最佳的超聲波功率后,在提取的液固比一定時隨著提取時間的增長粗糖產物的質量逐漸增加,在此條件下粗糖產物最佳的超聲時間為25min,此時超聲波法提取的粗糖產物為0.414g,提取率達到8.28%;然而并不是隨著超聲波照射時間的增加提取物就會增加,當照射時間達到一定限度時就會出現和功率過大一樣的問題,一是導致細胞壁中的某些成分被破壞,部分雜質流失;導致一些雜志的析出;二是導致多糖變性變質;根據上述現象可知,利用超聲波法提取多糖的最佳時間為25min
  3.3.3最佳液固比的確定:
  葡萄糖粗產物質量與超聲時間的關系圖
  由上圖可知,在使用了最佳的超聲功率和超聲時間提取多糖后,發現當固液比增加時提取物增多,但是當固液比達到一定值時提取物的質量的增加速度變慢,當液固比為20:1時,粗糖產物質量為0.446g,提取率為8.92%;當液固比為30:1時,粗糖產物為0.452g,提取率為9.04%,總提取率提高了約0.1%,鑒于操作流程、成本和繁瑣性等原因,最后得出的最合適的提取液固比為20:1
  根據以上實驗,我們得出了以下結論:在使用超聲法提取桑葉中多糖時最佳提取工藝為:超聲提取功率為300w,超聲提取時間為25min,提取所用的液固比為20:1,在上述條件下得到的粗糖產物為0.446g,提取率達到了8.92%

  3.4最佳醇沉純化條件的確定

  多糖含量與乙醇濃度的關系圖;
  由上圖可知在使用醇沉法提取多糖時在乙醇濃度為80%時得到的多糖產物最多,產量達32.19mg,產率為10.52%

  3.5多糖精品中的多糖含量的測定

  在使用最佳的水提法提取多糖后,將獲得的多糖粗產物進行除蛋白和活性炭脫色,之后用濃度為80%的乙醇進行醇沉法提取,最后將得到的多糖精品溶解在500mL蒸餾水中,對溶液進行和苯酚—硫酸法相同的操作,最后當其位于490nm位置的時候,獲得的的吸光度數值是0.8187,這是它的平均值。
桑葉中多糖的提取與分析方法的研究
  通過葡萄糖的標準曲線可以計算出待測樣品中的多糖濃度為:a=(0.8187-0.2668)/14.225=0.038mg/mL
  所以可以計算出精糖樣品中多糖的含量為w=0.038/0.1x1x100%=38.8%
  …….

  4、結論

  本文對桑葉中的多糖進行了提取、分離純化和分析檢測,根據目前的實驗室條件進行了很多單因素變量實驗得到了多糖水提法和輔助超聲提取法的最佳提取條件和使用最佳條件提取多糖時的提取率,同時還分析了粗多糖的分離提純和醇沉工藝,利用苯酚-硫酸法可以得到相關數據,進而能夠畫出葡萄糖的標準濃度曲線,并且在這個圖形的基礎上檢測多糖精品中的多糖重量??梢缘玫较旅鎺讉€結論,希望可以有助于桑葉中多糖的提取和檢測工作并提供相關的經驗參考。
  1、發現了葡萄糖的檢測分析方法:可采用苯酚-硫酸法,使用紫外光光度計在490nm處實施檢測工作。
  2、使用苯酚—硫酸法對不同標準濃度的葡萄糖溶液在490nm處的吸光度值進行測算,在這個基礎上將吸光度值放入縱坐標中,將葡萄糖濃度值放入橫坐標中,進而可以得到標準曲線,進而得到的回歸方程為y=14.225x+0.2668,相關系數R²=0.9471>0.9,和有關精度一致。
  3、改進了桑葉中多糖的提取法,體現在提取條件方面,進而得到水提法的最優實施條件,即溶液溫度為80℃,提取共兩個小時,提取了兩次,液固比為30:1。在這個最優的條件下可以得到粗糖產物0.306g,提取率為6.12%。
  4、對使用超聲法提取桑葉中的多糖的提取條件進行了改良,進而得到超聲法的最優提取條件,即超聲波300W,提取持續了一刻鐘,液固比為20:1,在此最優條件下共獲得0.446g粗糖,提取率達到了8.92%。
  5、改良了使用醇沉純化方法對多糖進行提取時的提取條件,得出了使用醇沉法對多糖進行提取時的最合適條件為:使用濃度為80%的乙醇,此時得到的多糖精品為32.19mg,提取率為10.52%
  6、使用苯酚—硫酸法計算出多糖精品中多糖的質量為12.5mg,含量為38.8%,提取率還是比較高的;以上數據為對多糖進行大規模工藝化提取和純化提供了理論支持
  …….

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