貴州兩種苦丁茶黃酮含量及抗氧化活性比較

　　苦丁茶(Rubus coreanus Maq.Var.corweanus)（Rosaceae）懸鉤子屬（Rubus Linn）多年生灌木，是藥食兩用植物?？喽〔栉陡?、酸、性溫，富含多種營養成分，具有較高的營養價值[1]。插苦丁茶果實、根、葉均可入藥，具有補腎固精、平肝明目、活血止血、祛風除濕、明目、除濕解毒等功效，主治陽痿、不孕、目生翳障、風濕痹痛、跌打損傷、骨折、月經不調等疾病。插苦丁茶中含有插苦丁茶甙[2]、覆盆子甙[3]、黃酮[4]等多種生物活性物質。黃酮類化合物具有清除血栓、降血壓、降血脂、促進腦部、心臟的血液循環等功效[5]，可用于治療冠狀動脈硬化、預防血液疾病等，可抑制腫瘤、消除體內自由基延緩衰老，可作為天然色素、甜味劑等食品添加劑[6]。黃酮類化合物的提取方法主要有：有機抗氧化活性提取法、微波提取法、超聲波提取法、堿性稀醇或堿性水提取法和酶法等[7-11]。微波提取法設備較貴，超聲波提取法提取率相對較低，堿性稀醇或堿性水提取法影響因素較多，酶法試劑相對較貴。與其它方法相比，有機抗氧化活性回流提取法，提取率高，設備簡單，試劑較便宜，影響回流提取的因素少，可操控性強，更容易實現從試驗室到工廠化生產。

　　Lascombe等[17]在研究尿路上皮細胞腫瘤發現正常尿路上皮組織中不表達苦丁茶黃酮類活性成分，但是隨著腫瘤病理分級的增高，E-cadherin表達會減少而苦丁茶黃酮類活性成分表達會增加，證實了鈣黏蛋白轉換在腫瘤進展過程中起關鍵作用，可以作為腫瘤進展及預后的一種標志物。Jaggi[18]等對44例抗氧化活性標本進行檢測，結果顯示苦丁茶黃酮類活性成分陽性率為45%，且腫瘤Gleason grade級別越高，苦丁茶黃酮類活性成分陽性率越高。N-cadherin的反常表達使得它可以成為檢測侵襲性抗氧化活性的生物標記物。

　　苦丁茶是具有多種保健功效的藥用資源。目前人們對苦丁茶的認識還遠遠不夠，其應用主要還停留在沖泡直飲方面，藥用價值方面的利用還不夠?？喽〔柚悬S酮類化合物具有抗菌、消炎、清熱解毒、鎮靜、利尿等作用外[7],它是大多數氧自由基的清除劑,對冠心病、心絞痛等疾病的治療效果顯著?？喽〔杓捌涮崛∥锞哂薪档脱獕?、調節血脂、改善心腦血管的血液循環、殺菌消炎等諸多功效[8]，是一種具有良好開發利用前景的飲用植物?？喽〔鑼嶋H上是一類代茶用植物的統稱，目前市場上銷售的苦丁茶制成品有大葉苦丁茶和小葉苦丁茶之分，兩者的原植物品種有較大差異。特別是抗自由基和抗癌、防癌的作用,使黃酮類化合物的研究進入了一個新的階段.[9]黃酮類化合物安全、無毒,在醫藥、食品加工等方面已被廣泛應用。在苦丁茶植物資源、化學組成、藥理作用等方面的研究已經取得了一些進展，但是在不同品種的苦丁茶化學成分對比、化學成分與藥理作用的關聯研究等方面的研究報導甚少[10]。黃酮類化合是廣泛分布于各種植物的一類次生代謝產物，是藥用植物的主要活性成分之一[11]。

　　苦丁茶是我國南部及西南部民間的傳統飲品，具有有利祛濕、消炎退熱、清心明目、提神醒腦的功效[8]?？喽〔璧闹参飦碓纯梢苑譃槎嗫贫鄬伲↖lex）和木犀科女貞屬（），其中冬青屬的植物有冬青Nex kudingcha C.J.Tseng、大葉冬青I.latifolia Thunb、枸骨I.cornuta Lindl.et part.等[12]。而木犀科來源的苦丁茶多見于我國南部及西南部地區，原植物有紫莖L.purpurascens Y.C.Yang、麗葉女貞、女貞、粗壯女貞.等[13]。經學者考證，貴州產苦丁茶的原植物以女貞屬植物粗壯女貞為主[14]?？喽〔柚泻休祁?、黃酮類、多酚類、苯丙素類、揮發油等多種化學成分[15]。黃酮類物質是一類廣泛存在于植物中的多酚類化合物，具有多種生物活性功能，如抗氧化、抗菌抗炎、抗病毒、抗過敏、以及血管舒張作用，還具有抑制脂質過氧化等作用[16]。由于黃酮類化合物種類繁多且結構復雜，并具有抗菌消炎、抗氧化、消除人體自由基、抗癌、調節心血管系統、內分泌系統、免疫系統等多種明確的藥理作用，一直以來都是國內外研究的熱點。

　　苦丁茶中包括黃酮苷和苷元的總黃酮已成為判定苦丁茶產品質量的標志性物質。由于苦丁茶日常主要用水泡服,苦丁茶水泡液中的黃酮應以親水性黃酮苷為主,但目前常用于提取苦丁茶總黃酮的方法為95%乙醇回流提取2次[17],得到總黃酮后，計算出兩種苦丁茶總黃酮含量，比較它們黃酮含量差異，用DPPH法測定兩種苦丁茶中總黃酮的抗氧化活性得到結論。

　　研究同時發現，采用現行的黃酮含量分析方法，貴州大葉苦丁茶葉中的黃酮含量比貴州小葉苦丁茶含量多，差距不是太大[18]。產生這種差別的原因尚有待深入研究，但作者推測，產生的主要原因是品種的差異，本實驗中，采用紫外分光光度法分析苦丁茶中的黃酮含量雖然比較簡便，但是，容易帶來分析誤差的因素很多，如標準對照品的選擇、樣品的前處理、苦丁茶葉中其他成分的干擾等。所以，苦丁茶中黃酮含量的測定方法尚有待進一步研究。

　　目前對貴州兩種苦丁茶中總黃酮含量及抗氧化活性比較研究比較少，呂雨晴，許海單，鮑潔以藝福堂大葉苦丁茶（杭州產）分別采用超聲提取法，微波輔助提取法，索氏提取法，回流提取法，提取了大葉苦丁茶中的總黃酮。對DPPH自由基清除率的測定，對ABTS自由基清除率的測定，對黃酮還原能力的測定得出了對苦丁茶中黃酮抗氧化活性數據，以苦丁茶中的黃酮含量考察超聲法，回流法，索氏法對苦丁茶中總黃酮的影響，以對DPPH自由基清除率的測定，對ABTS自由基清除率的測定，對黃酮還原能力的測定，得出了對苦丁茶中黃酮抗氧化活性能力的強弱，得出了不同方法對苦丁茶中黃酮含量差異的影響，以料液比1:40（g:ml）加入溶劑，浸漬提取黃酮大于回流提取大于超聲提取大于微波提取大于索氏提取的結論，可以參考選取提取黃酮的方法，同時他也得到了超聲提取黃酮的抗氧化活性是最強的方法，所以參考前人們的科研成果，我得到了提取黃酮的方法。

　　范東翠，丁曉雯測定了山蒼子果實的無水乙醇提取液的抗氧化活性，實驗結果表明，苦丁茶提取液在5ml時，其清除率可達87.5%。程超等以山雞椒為原料，通過超聲波輔助水蒸氣蒸餾法對山雞椒揮發油進行提取，利用鄰苯三酚自氧化法和Fenton系統對自由基的清除作用，結果發現山雞椒揮發油粗提物對羥自由基和超氧自由基具有明顯的清除作用[20]。

　　倪峰等以木姜子根為原料，提取了木姜子根中的多糖，以宮頸癌U14為細胞模型并用木姜子根多糖提取物進行體內和體外對瘤細胞直接作用，結果顯示研究發現，當木姜子多糖在150mg/kg濃度，有顯著的抗腫瘤作用，多糖可以直接抑制HL60細胞的增殖[20]。

　　1.6對心血管疾病的作用

　　孫學惠等利用大果木姜子油對離體心臟平滑肌和血管平滑肌進行試驗研究，結果發現大果黃酮對心臟平滑肌和血管平滑具有松弛作用；并利用貓急性心肌缺血的保護試驗，結果也發現大果木姜子油對貓的動脈血管條亦有收縮作用[21]。這些證明木姜子對心血管疾病具有治療作用。

　　1.6結語

　　綜上所述，苦丁茶化學成分復雜，且具有多種生物活性，具有很高的藥用價值，但是，目前對木姜子的開發研究還不夠，大大限制了木姜子在藥物方面的應用，因此，加大對木姜子的研究力度，對木姜子的開發利用是很有必要的。

　　2.1.1研究目的

　　貴州是遵義余慶栽培面積最大、栽培歷史最悠久的地區之一。貴州苦丁茶子早已銷往全國各地，受到消費者好評，尤其是在調料方面應用最廣泛。但目前關于貴州苦丁茶中活性成分的研究報道較少，這大大阻礙了苦丁茶產品的發展。如果能夠通過研究明確黔產木姜子中活性成分的含量及其作用，便可根據現代食品藥品的需要，開發出貴州苦丁茶的產品。為了更好的開發利用貴州苦丁茶這一藥食兩用農業資源，造福人類，本研究對貴州兩種苦丁茶中的總黃酮含量進行了進行了比較，而且比較了它們抗氧化活性的強弱。目的在于確定貴州大葉苦丁茶及小葉苦丁茶中總黃酮的含量和抗氧化活性的強弱。

　　2.1.2研究意義

　　苦丁茶中的黃酮已經被證實具有抗炎抗腫瘤等多種功效，還有其他生物堿，揮發油等多種化學成分也具有重要的藥用價值。因此，苦丁茶在醫藥和食品方面有重大意義，市場上已經有各種的苦丁茶產品，如苦丁茶銀杏片、苦丁茶等，但這些產品的原材料都是苦丁茶。貴州苦丁茶產量大、化學成分豐富、含量高，卻只主要作為調料銷售，這樣一來就大大限制了銷量，嚴重阻礙了貴州苦丁茶藥物方面的發展。因此，取兩種不同貴州苦丁茶研究它們黃酮含量差異及抗氧化活性差異，為苦丁茶作天然抗氧化劑的應用提供實驗依據。

　　2.2.1研究內容

　　1.本試驗以總黃酮含量及抗氧化活性為考察指標,以遵義的大葉苦丁茶及小葉苦丁茶為考察因素，通過比較兩種苦丁茶中總黃酮含量及抗氧化活性差異得到結論。

　　2.采用超聲波提取總黃酮方法，以蘆丁為標準品，計算出總黃酮的濃度，利用公式計算出黃酮的總含量，用DPPH法測定苦丁茶中總黃酮的抗氧化活性

　　3.完成以上步驟，得出結論。

　　4.并利用紫外-可見分光光度計貴州兩種苦丁茶中總黃酮的含量進行比較，最后通過DPPH自由基清除率實驗測定貴州苦丁茶中總黃酮的抗氧化活性并進行比較。

　　2.2.2設計思路

　　2.2.2.1原料預處理

　　苦丁茶干品→干燥→粉碎→苦丁茶粗粉

　　2.2.2.2苦丁茶總黃酮的提取流程

　　2.2.2.3含量測定

　　1.本試驗以總黃酮含量及抗氧化活性為考察指標,以遵義的大葉苦丁茶及小葉苦丁茶為考察因素，通過比較兩種苦丁茶中總黃酮含量及抗氧化活性差異得到結論。

　　2.采用超聲波提取總黃酮方法，以蘆丁為標準品，計算出總黃酮的濃度，利用公式計算出黃酮的總含量，用DPPH法測定苦丁茶中總黃酮的抗氧化活性

　　大葉苦丁茶和小葉苦丁茶干品各250g；蘆丁標注品20mg；DPPH20mg。

　　3.2.1儀器設備

　　表3.1儀器設備

　　名稱型號廠家

　　恒溫水浴鍋四孔（AA605112）上海梅香儀器有限公司

　　旋轉蒸發儀RE-52A上海亞榮生化儀器廠

　　循環水真空泵SHB-Ⅲ上海亞榮生化儀器廠

　　紫外-可見分光光度計

　　電子天平

　　電熱鼓風干燥箱

　　超高速智能粉碎機722

　　MA110

　　101-2型

　　CS-1000上海欣茂儀器有限公司

　　上海良平儀器儀表有限公司

　　天津市泰斯特儀器有限公司

　　武義海納電器有限公司

　　3.2.2主要實驗試劑

　　表3.2實驗主要試劑

　　名稱分子式分子量純度廠家

　　無水乙醇CH3CH2OH 46.07 AR

　　95%乙醇

　　3.2.3主要試劑的配制

　　5%亞硝酸鈉溶液的配制：稱取5g亞硝酸置于100mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，既得5%的亞硝酸鈉溶液，密塞待用。

　　10%硝酸鋁溶液的配制：稱取10g硝酸鋁置于100mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，既得10%的硝酸鋁溶液，密塞待用。

　　4%氫氧化鈉溶液的配制：稱取4g氫氧化鈉置于100mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，既得4%的氫氧化鈉溶液，密塞待用。

　　3.3.1標準曲線的繪制

　　3.3.1.1對照品溶液的配制

　　精密稱取蘆丁對照品20mg，用70%乙醇溶解，并定容至50mL容量瓶中，密塞備用，即可得到0.4mg/mL的蘆丁標準溶液。

　　3.3.1.2標準曲線的制備

　　分別吸取蘆丁對照液0ml、1mL、2mL、3mL、4.0mL、5mL至于5支25mL比色管中，加入5%亞硝酸鈉溶液4mL，搖勻放置5min，加入10%硝酸鋁溶液4mL，放置5min，加入4%氫氧化鈉溶液16mL，再用70%乙醇稀釋至刻度，放置0.5h，通過最大吸收波長掃描，蘆丁標準品在505nm出有最大吸收值（如圖3.3.1所示），故于505nm波長處以空白作對照進行比色測定。

　　圖3.1最大吸收波長的測定

　　3.3.2貴州苦丁茶黃酮提取的研究

　　通過查閱相關文獻了解到從木姜子中提取苦丁茶總黃酮的溶劑主要有甲醇及乙醇兩鐘，但考慮到實驗室操作安全及回收利用等因素，本試驗以乙醇為提取溶劑。

　　3.3.2.1乙醇提取兩種苦丁茶黃酮含量比較

　　稱取大葉苦丁茶和小葉苦丁茶粗粉各5g，加70%的乙醇，于70℃恒溫水浴中回流提取2h，分3次提取。提取完成后抽濾，合并濾液，減壓濃縮并定容至25mL，按照標準曲線的制備方法檢測粗提物中黃酮的含量，平行測定三次，取其平均值。

　　表4.1總黃酮系列標準溶液的吸光度

　　蘆丁液溶度（mg/ml）0.016 0.024 0.032 0.040 0.048

　　吸光值A 0.161 0.254 0.338 0.430 0.519

　　根據上表以橫坐標為蘆丁標準溶液溶度，縱坐標為吸光值繪制標準曲線圖如下：

　　圖4.1蘆丁標準曲線圖

　　4.2.1平行測定表一

　　表4.3不同苦丁茶溶液體積總黃酮的檢測結果

　　苦丁茶體積（ml）0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

　　吸光值A 0.371 0.481 0.513 0.501 0.497

　　總黃酮含量（mg/g）10.052 12.582 13.321 13.034 12.942

　　分析數據，作出對不同濃度大葉苦丁茶含量的圖：

　　4.2.2平行測定表二

　　表4.3不同苦丁茶溶液體積總黃酮的檢測結果

　　苦丁茶體積（ml）0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

　　吸光值A 0.381 0.482 0.514 0.50 0.498

　　總黃酮含量（mg/g）10.053 12.583 13.322 13.034 12.934

　　分析數據，作出對不同濃度大葉苦丁茶含量的圖：

　　由上圖表可知，貴州苦丁茶和BHT對DPPH的清除率在不同濃度下清除能力不同，在本實驗測定的濃度（0.002、0.004、0.005、0.008、0.01mg/mL），貴州苦丁茶對DPPH的清除率是低于對照組BHT的。但是其清除率隨著貴州苦丁茶濃度的提高而呈現上升的趨勢。這有可能是由于木姜子揮發油濃度的提高，其抗氧化活性物質含量也隨之增加，從而提高了貴州苦丁茶對DPPH的清除率，也得到了貴州遵義余慶小葉苦丁茶清除率大于貴州大葉苦丁茶，即抗氧化活性也大于它。

　　1.通過單因素試驗確定了黔產木姜子正交試驗的因素范圍，在單因素試驗中初步確定薯蕷皂苷的提取條件為乙醇濃度70%，時間2h，料液比1:20，提取溫度為70℃最佳。

　　2.對正交試驗結果的分析，考慮多方面的因素，最終確定了黔產木姜子總黃酮的提取工藝。

　　4.采用可見分光光度法對木姜子粗提物進行分析，得黔產木姜子中總黃酮的含量。說明木姜子有很大的發展前景，不僅僅是停留在食品上，也可以向藥品、保健品方向開發。

　　從木姜子中提取黃酮的方法有很多，由于條件因素的影響，本實驗只選擇了一種方法進行提取比較。而試驗過程中提取部分由于時間和耗材的關系只做了兩組平行，難免會存在誤差。

　　木姜子性辛、苦、溫，溫補而微香，不僅是臨床上一種常見的中藥，也是一種廣受歡迎的調料，對于一些體質不好的人來說，也是傳統的保健食品。而對木姜子的研究還很少，隨著研究的深入，明確木姜子的化學成分和生理活性作用原理，對其化學成分和分離方法進行研究，找到工藝環境友好，無污染的研究路線。那么，可以根據醫療和保健的需要開發產品，如木姜油、木姜子食物添加劑等?？傊?，木姜子在醫藥、食品等方面都會具有很好的應用潛力和研究價值。

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　　[19]苦丁茶及苦丁茶片暫行質量標準.蘇衛藥(81)準字82號

　　致謝

　　論文到此已圓滿完成，在整個過程中從最初的確定題目到實驗方案的設計、實驗器材和試劑的購買、實驗操作，再到完成實驗、處理數據、撰寫論文，每一個環節都凝聚著劉瑩老師的關心和指導。論文初稿完成時有很多不規范的地方，感謝劉老師給予我寶貴的建議。劉老師對待知識和工作的態度深刻的影響著我，這幾個月里我從劉老師那里學到了很多東西，也感受到了老師對待生活的樂觀豁達。

　　論文到此結束，在此，我衷心的感謝劉老師對我的精心輔導和在方面給予我的關懷和教導。在這里，我真誠地向您說聲“謝謝”；同時，我還要感謝我的班主任李卓林老師，感謝您四年來對我的幫助和教導；感謝張瑤、黎明月、黃光陽等同學在我整個實驗過程中給予我的幫助和支持。

　　最后，向食品與制藥工程學院所有關心和幫助過我的老師和同學表示誠摯的謝意！向論文的評閱人和答辯委員會的老師們表示最誠摯的謝意！